western blot – The Science Decanter

Cet article marque le début d’une série sur les expériences en science. La plupart du temps, les médias ne montrent pas comment les chercheurs obtiennent les résultats ou les découvertes. Je trouve que comprendre les expériences en science aident à mieux comprendre la science en général, mais cela aide également à développer un esprit critique quand on lit de la vulgarisation scientifique. Aujourd’hui nous allons nous concentrer sur l’utilisation des anticorps dans les labos. Les anticorps sont essentiels pour l’étude des protéines. Nous verrons d’abord comment nous visualisons les protéines avec l’immunohistochimie, ensuite nous verrons comment nous quantifions les protéines avec le Western blot, et enfin nous parlerons de comment nous identifions les cellules avec la cytométrie en flux.

Avant toute chose, nous devons répondre à la question: pourquoi utiliser les anticorps? Comme on l’a vu dans notre série sur le système immunitaire, les anticorps sont capables de se lier à un antigène pendant une attaque immunitaire. Un antigène n’est qu’une partie de protéine pathogénique, du coup les chercheurs ont développé une façon de créer des anticorps spécifique à une protéine d’interêt. De nos jours, nous pouvons obtenir des anticorps spécifiques à n’importe quelle protéine connue. Un autre avantage des anticorps est leur spécificité. En principe, les anticorps ne peuvent s’attacher qu’à la protéine qu’ils reconnaissent et rien d’autre. Ce n’est pas totalement vrai; les macrophages peuvent s’attacher aux anticorps par exemple. Mais nous some capable d’empêcher toutes les liaisons non voulues [source].

Immunohistochimie: Comment voir les protéines

L’immunohistochimie (IHC) est une technique utilisée par la plupart des labos. Pour mieux la comprendre, je vais l’expliquer dans le contexte d’une expérience. Disons que je veux savoir dans quelle partie du cerveau la protéine adrénaline est exprimée le plus. Pour ce faire, je vais prendre un cerveau de souris et le couper en fine lamelle. Ensuite, je vais le bloquer, ce qui veut dire empêcher les interactions non voulue que l’anticorps peut avoir. Ensuite, je vais ajouter mon anticorps contre l’adrénaline. Pour visualiser la protéine, j’ai besoin d’un autre anticorps, mais celui-ci sera spécifique au premier anticorps. Du coup, notre tissus a deux anticorps: l’anticorps primaire spécifique à l’adrénaline, et l’anticorps secondaire spécifique à l’anticorps primaire. L’anticorps secondaire est modifié pour qu’il contienne un marqueur fluorescent, ce qui va nous permettre de voir la protéine. Maintenant que notre expérience est terminée, nous pouvons aller observer notre tissu sous un microscope et voir les protéines (sous la formes de points colorés) [source].

L’IHC offre beaucoup d’avantages, et le principal est la localisation. Dans notre expérience par exemple, je vais pouvoir savoir dans quelle partie exacte du cerveau l’adrénaline est exprimée le plus, et quelle partie en a le moins. De plus, l’IHC est une expérience assez simple et peu chère. De plus, il est possible de quantifier les protéines après un IHC, mais ce n’est pas la meilleure façon de faire. L’IHC a aussi une utilisation clinique. Par exemple, on peut prendre des tissus de patients et déterminer l’avancement du cancer. L’IHC a aussi ses limites. D’abord, nous ne pouvons utiliser qu’un nombre limité d’anticorps, environ 4, ce qui limite le nombre de protéines qu’on peut visualiser en une fois. De plus, le tissu qu’on utilise est mort, du coup nous perdons les mouvements des protéines. Enfin, l’expérience est sensible à la lumière, à cause du marqueur fluorescent. Du coup, si on expose nos tissus à la lumière pour trop longtemps, nous perdrons l’expérience complètement [source / source].

Les Western blots: comment quantifier les protéines

Les western blots sont des expériences phares dans les labos. Encore une fois, nous expliquerons cette technique à travers une expérience. Je veux savoir si stresser un animal va augmenter la production d’adrénaline. Pour cela, je vais prendre une souris et la stresser, puis prendre un peu de ses tissus. Comme groupe témoin, je vais utiliser les tissus d’une souris qui n’a pas été stressée. Je vais ensuite décomposer les tissus pour qu’il n’en reste que les protéines, pour ensuite les séparer par taille. Pour ce faire, je vais faire une électrophorèse par gel. Nous allons créer une membrane spéciale dans laquelle nous mettons nos tissus. Ensuite, nous injectons un courant électrique dans la membrane. Les protéines ont toutes une charge négative et du coup, comme un aimant, elles sont attirées par les charges positives. Du coup nos protéines vont descendre dans la membrane vers le positif. Cependant, notre membrane rend le mouvement très difficile pour les protéines plus lourdes. Du coup notre membrane contient toutes les protéines du tissu, avec les protéines plus légères vers le bas, et les plus lourdes vers le haut. Nous transférons ensuite nos protéines sur une autre membrane plus facile à manipuler et à conserver, encore une fois à l’aide d’un courant électrique. Ensuite nous allons bloquer la membrane comme pour un IHC, et ajouter notre anticorps primaire spécifique à l’adrénaline. Notre anticorps secondaire est différent d’un IHC, car au lieu d’un marqueur fluorescent, il contient une autre protéine appelée peroxydase de raifort (HRP). Cette protéine, quand elle est mise en contact avec une autre protéine appelée substrat d’HRP, nous permet de visualiser notre protéine d’intérêt sous la forme d’une bande noire. Pour ce faire, nous allons mettre le substrat sur la membrane, et y mettre un film spécial. Le film est ensuite exposé dans une machine pour y voir les protéines [source / source].

L’avantage du Western blot est la possibilité de quantifier les protéines. Plus la bande noire est épaisse, plus il y a de protéine. Dans notre expérience, la souris stressée montrera une bande plus épaisse que la souris non-stressée. Les Western blots sont également très sensibles: ils peuvent détecter une infime quantité de protéine, ce qui nous permet d’étudier des protéines plus rares. Malheureusement, les Western blots ont aussi leurs désavantages, le principal étant leur difficulté. Comme vous avez pu le deviner en lisant le protocole, c’est une expérience très dure à faire, et elle est également très longue. Personnellement, cela me prend deux à trois jours pour finir un Western. C’est aussi une expérience assez chère. Un autre problème est la difficulté à analyser l’expérience.Les Western ont tendance à montrer des résultats incorrects, la plupart du temps à cause d’une erreur pendant la préparation. Malheureusement, il est impossible de savoir si quelque chose s’est mal passé avant la fin de l’expérience [source / source].

Cytométrie en flux: comment identifier les cellules

La cytométrie en flux n’est pas utilisée dans la plupart des labos. C’est une technique essentielle dans les labos d’immunologie, et dans beaucoup d’hôpitaux également. La cytométrie en flux a beaucoup d’utilisations, mais la plus intéressante est l’identification des cellules. Étudions cette technique avec une autre expérience: Je veux savoir si les cellules du système immunitaires sont capables de produire de l’adrénaline. Et si oui, quelle cellules en sont capables. Pour ce faire, je vais prendre le sang d’une souris, et le traiter pour qu’il ne reste que les cellules. Ensuite je vais bloquer mon échantillon et ajouter mes anticorps primaires. Pour cette expérience, j’utiliserais des anticorps primaires spécifiques à l’adrénaline, au CD4, au CD8, et au récepteur de la cellule B. Ensuite, j’ajoute mes anticorps secondaires avec marqueur fluorescent. chaque anticorps primaire est associé à un seul anticorps secondaire, et chaque anticorps secondaire a un marqueur fluorescent différent. Ensuite, nous allons analyser notre échantillon dans une machine appelée un cytomètre. Cette machine analyse les cellules une à la fois, et à l’aide de laser va identifier quels anticorps sont attachés aux cellules [source].

Analyser une expérience de cytométrie en flux est difficile. Pour notre expérience, je vais séparer mes cellules en trois groupes: les cellules avec l’anticorps CD4 sont identifiées comme des lymphocytes T CD4, les cellules avec l’anticorps CD8 sont des lymphocytes T CD8, et les cellules avec l’anticorps récepteur de cellule B sont des lymphocytes B. Ensuite, dans chaque groupe, je vais pouvoir voir si ils ont également l’anticorps adrénaline, et combien de cellules l’exprime. Enfin, le cytomètre me permet de reprendre mon échantillon pour l’étudier encore, mais si je le veux, je peux ne prendre que les cellules qui ont les anticorps pour CD4 et adrénaline, et pas les autres. Comme vous pouvez le voir , la cytométrie en flux permet de faire plein de choses: identifier des cellules, voir quelles cellules expriment quelles protéines, séparer notre échantillon pour qu’il ne contienne que des cellules spécifiques, etc… La cytométrie en flux a d’autres avantages: certains cytomètre permettent d’utiliser plus de 10 anticorps, ce qui permet d’étudier plusieurs protéines en même temps. De plus, puisque le cytomètre analyse les cellules une à la fois, c’est extrêmement spécifique. Mais comme toute expérience, elle a aussi ses limites. D’abord, l’expérience est très difficile, et le cytomètre est une machine extrêmement dure à utiliser. De plus, cette expérience est très chère. nos échantillon perdent leur intégrité, et contrairement à l’IHC, on perd la localisation des protéines [source / source].

Today is the start of a series about scientific experiments. Oftentimes in the public media, scientific discoveries are presented without explaining how scientists got those results. Understanding how experiments work is a great way to understand science in general, and also be able to spot problems or misunderstandings spread by the lay media. Today, I will focus on the use of antibodies in labs. Antibodies are essential for any lab that studies proteins. We will talk about protein visualization through the use of immunohistochemistry, protein quantification via Western blots, and finally, we will see cell identification with flow cytometry.

Before going into the experiments, one question must be answered: why antibodies? As we saw in our series on the immune system, the antibodies are able to bing a specific antigen during an immune attack. An antigen is simply a specific spot on a pathogenic protein. So scientists thought of making antibodies to be specific to a protein of interest, and nowadays, we can get antibodies for virtually any protein in any animal that we want. Another advantage of antibodies is their specificity. Theoretically, they will only bind to the protein they recognize and nothing else. While this is technically not true, as macrophage can bind antibodies for example, any other binding can be prevented during the experiment so that they will only bind the protein of interest [source].

Immunohistochemistry: how scientist see the proteins

Immunohistochemistry (IHC) is a technique that most lab will use. I will explain it through a mock experiment. I want to know where the protein adrenaline is expressed the most in a mouse brain. To do so, I will slice the brain in thin slices, and block them. Blocking is the technique that prevents any non-wanted interaction with your antibody. Then I will put my antibody against adrenaline. Now, to visualize the protein, we need a secondary antibody that is specific to the first one. Thus we have a brain slice with our primary antibody binding adrenaline, and our secondary antibody binding the primary one. Our secondary antibody was modified so that it has a fluorescent tag on it. It’s this tag that will allow us to see the protein. And now the experiment is done, we can go to the fluorescent microscope. On there, we will be able to see the proteins (in the form of coloured dots) [source].

There are many advantages to IHC, and the main one is localization. for example, in our adrenaline experiment, I will be able to see in which specific parts of the brain there is more adrenaline, and which have less. Next, it is a very easy and relatively cheap experiment. Further, we can also quantify how much protein there is by counting the dots, although this is not the best way to quantify proteins. However, the quantification can be region-specific, which is good for some proteins. IHC can also be used in more clinical applications. For example, taking tissue samples of patients, we can use IHC to determine the cancer stage for example. However, IHC also has some limitations. First, we can only use a limited number of antibodies, so we can visualize only about 4 proteins in one tissue. Further, the tissue is dead, thus we lose the protein movements. Lastly, the experiment is very sensitive to light (due to the fluorescent tag). If exposed to light for too long, then the tag will not work anymore and the experiment will be lost [source / source].

Western Blots: how scientists count proteins

Western blots are also a staple in scientific labs. I will explain it through this experiment: I want to know if stressing a mouse will increase the production of adrenaline. To do so, I will stress one mouse, and then take its tissues. I will take the tissues of another mouse that has not been stressed as a control. I will take the tissues and break them down so that we only have the proteins. Now I will separate the proteins based on size. To do so, we will perform a gel electrophoresis. We will create a special membrane in which we will put our samples. Then we will run an electric current through the membrane. Proteins are negatively charged and like a magnet, they are attracted to positive charge. This will allow the proteins to travel down the membrane. However, our membrane makes it harder for heavy proteins to travel. Thus in the end, our membrane will have all of our proteins, with the lighter ones at the bottom of the membrane and the heavier ones at the top. Next, we have to transfer our proteins on another membrane that is easier to work with and that we can keep for a longer time. This is also done with electricity. We will then block the membrane (similar to a IHC), and add the primary antibody against adrenaline, and our secondary antibody. This time however, our secondary does not have a fluorescent tag, instead it has another protein called horseradish peroxidase (HRP). This protein, when in contact with another protein called HRP substrate, will allow us to visualize our protein of interest as a black band. To do so, the substrate will be applied on the membrane, and then a film will be placed on the membrane. The film will then be exposed in a special machine so that the bands will be visible [source / source].

The biggest advantage of Western blotting is the ability to quantify. Basically, the bigger the black band, the more proteins we have. In our adrenaline experiment, the stressed mouse will have a bigger band than the non-stressed mouse. Western blots are also extremely sensitive: they can detect a very small amount of protein, which allows us to study rarer proteins more easily. However, Western blots also come with their disadvantages. The main one is its difficulty. As you may have guessed after reading the protocol, this experiment is very hard to do, and a lot of things can go wrong. It is also a very long experiment (it usually takes me two to three days to finish a blot), and it’s quite expensive as well. Another problem is the difficulty of analyzing the results. Western blots are prone to show wrong or misleading results, either because the experiment was not performed well, or because the primary antibody was not as specific as we thought. Unfortunately, there is no way of knowing what went wrong until the very end of the experiment, making this experiment very demanding [source / source].

Flow Cytometry: how scientist can identify cells

Flow cytometry is a rarer experiment. It is mostly used in immunological labs but other disciplines can also use it. It also has a big use in hospitals. Flow cytometry has many uses, but the most interesting one is to identify cells. Let’s go through it with another experiment: I want to know if immune cells are able to produce adrenaline, and if they are, which one of them are able to do so. For this, I will take a mouse and take some of their blood. I will treat the blood so that only the cells are in the sample. Then I will block it and add my primary antibodies. Here I will add antibodies for adrenaline, CD4, CD8, and B cell receptor. Then I add my secondary antibodies with my fluorescent tag. Each primary antibody has its own secondary antibody, and each secondary antibody has a different fluorescent tag. Then I can go to a machine called a cytometer. This machine will analyze the cells one by one and shine lasers on them to identify which antibody they have. We can then see which cell expresses which antibody [source].

Analyzing a flow cytometry experiment is hard. In our mock experiment, I will separate my cells into three groups: the cells that have the CD4 antibody will be CD4 T lymphocytes, the cells that have the CD8 antibody will be CD8 T lymphocytes, and the cells with the B cell receptor antibody will be B cells. Then, within each group, I can see if they express the adrenaline antibody, and how many cells within each group express it. Finally, the cytometer can allow me to take my sample back for further analysis, but if I want to, I can take only the cells that express both CD4 and adrenaline antibody, and discard the rest. As you can see, many things can be done with flow cytometry: we can identify cells, see which proteins express a specific cell, sort our cell so that our sample only contain specific cells, etc… Flow cytometry has other advantages: with the right cytometer, you can have more than 10 different antibodies, allowing you to have very specific subset of cells. Since the cytometer analyzes the cells one at a time, it is extremely specific. However, just like any experiment, there are some flaws. The biggest one is the difficulty: the experiment is very hard to perform, and the cytometer is extremely hard to use. It is also an extremely expensive experiment. Another problem is that we lose the integrity of the tissue, thus unlike IHC, we lose some of the localization [source / source].

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Comprendre la science: les anticorps